四川傳統洗澡泡菜是餐飲行業中常用的一種特殊泡 菜。其做法是將白蘿卜(卷心菜、紅皮蘿卜等)刀工成型后采用食鹽干腌, 脫掉多余水分, 放入泡菜壇, 倒入復配的泡菜水, 泡制 2~3 d 而成。蔬菜在微生物的作用下進行微發酵, 其特殊的咸酸味以及爽脆口感的形成與壇中微生物菌群結構等因素密切相關，本實驗旨在優化低鈉咸味劑制備四川傳統洗澡泡菜的最佳工藝配方以及四川傳統洗澡泡菜菌落結構、風味特征, 了解低鈉咸味劑對四川傳統洗澡泡 菜菌落結構、風味特征的影響, 為低鈉咸味劑在四川傳統洗澡泡菜中的應用提供數據支持。
參考文獻：肖嵐,廖佑琴,王新程等.低鹽洗澡泡菜菌落結構及其風味研究[J].食品安全質量檢測學報,2023,14(10):22-30.DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2023.10.012. 材料與方法
材料
低鈉咸味劑(天津春發生物科技有限公司); 花椒、白蘿卜(四川省成都龍泉永輝超市); 廣樂野山椒(四川廣樂食品有限公司); 白砂糖(福建好日子食品有限公司); 白醋(千千味業股份有限公司); 二鍋頭(北京順心農業股份有限公司牛欄山酒廠); 食鹽(四川久大制鹽有限公司)。DNA 提取試劑盒(南京集思慧遠生物科技有限公司);MiSeq Reagent Kit V3 基因測序試劑盒(美國 Illumina 圣地亞哥公司)。
低鈉咸味劑(天津春發生物科技有限公司); 花椒、白蘿卜(四川省成都龍泉永輝超市); 廣樂野山椒(四川廣樂食品有限公司); 白砂糖(福建好日子食品有限公司); 白醋(千千味業股份有限公司); 二鍋頭(北京順心農業股份有限公司牛欄山酒廠); 食鹽(四川久大制鹽有限公司)。DNA 提取試劑盒(南京集思慧遠生物科技有限公司);MiSeq Reagent Kit V3 基因測序試劑盒(美國 Illumina 圣地亞哥公司)。
儀器
FlavourSpec@風味分析儀(德國 G.A.S 公司); α-ASTREE電子舌(法國 Alpha MOS 公司); MiSeq 測序儀(美國 Illumina圣地亞哥公司); ML204 萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多國際貿易有限公司); GZ-150-S 型生化培養箱(韶關市廣智科技有限公司); MXT-5 (15 m×0.53 mm, 0.5 μm)色譜柱(美國 RESTEK 公司); KQ5200E 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
方 法
洗澡泡菜的制備
在前期的單因素實驗中發現低鈉咸味劑替代率、泡制溫度、泡制時間 3 個因素對洗澡泡菜風味的影響較大, 在此基礎上, 設計了 3 因素 3 水平的正交實驗, 以感官評分為依據, 篩選出評分最高的 3 個處理組, 進一步優化其工藝配方。
(1)工藝流程
原料預處理→干腌→脫鹽→裝入泡菜壇→倒入復配的泡菜水→恒溫泡制。
(2)工藝要點
原料預處理: 將白蘿卜去皮, 切成半徑長 3 cm, 厚0.5 cm 的扇形薄片。干腌: 稱取 500 g 的白蘿卜用 30 g 食鹽干腌 15 min。脫鹽: 洗去白蘿卜上多余食鹽, 瀝干。
泡菜水的配制: 純凈水 800 g、野山椒 35 g、野山椒水 20 mL、味精 5 g、白糖 40 g、花椒 2 g、白酒 15 g、白醋 25 g, 低鈉咸味劑替代量見表 1, 攪拌均勻后倒入泡菜壇, 泡菜水淹沒白蘿卜。
表 1 樣品處理條件表
注 : 對照組食鹽含量 5.38%,
DNA 提取及 16S rDNA 分析
提取洗澡泡菜中微生物的總DNA, 對微生物 DNA 的濃度、純度以及完整度進行檢測和擴增測序, 用特定引物對微生物的16S V4~V5 區域進行擴增, 得到的增序片段采用 Illumina Novaseq6000 測序, 測序得到的序列進行 16S rDNA 分析。
提取洗澡泡菜中微生物的總DNA, 對微生物 DNA 的濃度、純度以及完整度進行檢測和擴增測序, 用特定引物對微生物的16S V4~V5 區域進行擴增, 得到的增序片段采用 Illumina Novaseq6000 測序, 測序得到的序列進行 16S rDNA 分析。
洗澡泡菜氣相色譜-離子遷移色譜測定
對陽性對照組(四川傳統洗澡泡菜)和低鈉咸味劑處理組進行氣相色譜-離子遷移色譜法(gas chromatography-ion mobility spectrometry, GC-IMS)檢測。取 4.00 g 樣品置于 20 mL 頂空瓶, 自動頂空進樣(進樣針溫度 80℃、孵育溫度 60℃、孵化轉速 500 r/min), 選擇 GC-IMS 單元[色譜柱型號為 MXT-5 (15 m×0.53 mm,0.5 μm)、柱溫 60℃、載氣 N2、漂移管溫度 45℃、進樣體積 500 μL、孵育時間 20 min], 運行 30 min。
洗澡泡菜電子舌檢測
取 10 g 洗澡泡菜, 制備 20 mL 研磨液, 將研磨液移入100 mL 容量瓶定容到 100 mL, 用超聲波浸提 30 min 后,取 80 mL 上清液移至專用燒杯進行電子舌檢測。
取 10 g 洗澡泡菜, 制備 20 mL 研磨液, 將研磨液移入100 mL 容量瓶定容到 100 mL, 用超聲波浸提 30 min 后,取 80 mL 上清液移至專用燒杯進行電子舌檢測。
結果與分析
洗澡泡菜中細菌和真菌的 Alpha 多樣性分析
洗澡泡菜中細菌的 Alpha 多樣性分析
本研究的對照組與 3 個處理組的 Goods coverage 指數接近于 1(或等于 1), 說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種, 本研究數據有效。Alpha 多樣性主要是指樣本中群落的多樣性, Observed features 指數和 Chao1 指數反映樣品中群落的豐富度(species richness), 即指群落中物種的數量, 數值越大物種數越多。表 2 可知, JY2 的 Chao1 值(107.50)、Observed features 值(105.00)最高, 故 JY2 的細菌物種最豐富, JY1、JY3 的 Chao1 值、Observed features 值均最低, 故其細菌物種最少。其原因可能是適當的食鹽濃度、泡制溫度有利于細菌菌落在 JY2 中大量繁殖, 使其細菌物種最為豐富; 高濃度的食鹽、過低或過高的泡制溫度抑制了細菌菌落在 JY1 和 JY3 中生長繁殖, 導致 JY1 和JY3 的細菌物種數最少。結果提示低鈉咸味劑替代率、泡制溫度會影響細菌菌落的生長, 導致洗澡泡菜內細菌群落結構發生改變。Simpson 指數反映了物種分配均勻性和多樣性, 從表 2 可知, 除 JY2 的 Simpson 指數以外, JY1 的Simpson 指數與對照組一致(均為 0.89), JY3 的 Simpson 指數(0.90)大于對照組, 進一步說明了低鈉咸味劑替代率、泡制溫度對洗澡泡菜中細菌的多樣性存在影響。
表 2 樣品中細菌 Alpha 多樣性指數和種群豐富度
洗澡泡菜中真菌的 Alpha 多樣性分析
由表 3 可知, 各組的 Simpson 指數均接近 1, 說明其均勻度高; Goods coverage 的值均接近 1, 說明測序深度都基本覆蓋了所有物種, 本次實驗是有效的。真菌的 Chao1指數和 Observed features 指數都高于細菌, 說明洗澡泡菜中的真菌物種數目較細菌豐富, JY2 的 Chao1 值(507.4)和Observed features (503)值最高, 說明 JY2 的真菌物種數最多, JY3 的 Chao1 值(260.0)和 Observed features (260)值最低,故 JY3 的真菌物種數最少, JY1 和對照組的 Chao1 值和Observed features 值最接近, 故 JY1 與對照組的真菌物種數最為相近。綜上, JY1 在真菌物種的豐富度、分配均勻度以及物種的多樣性程度與對照組的相似度最高。
表 3 樣品中真菌 Alpha 多樣性指數和種群豐富度
表 3 樣品中真菌 Alpha 多樣性指數和種群豐富度
洗澡泡菜中真菌和細菌的物種注釋
洗澡泡菜中細菌的物種注釋
對相對豐度前 20 的物種進行聚類分析, 如圖 1 所示,細菌菌群在屬水平上相對豐度最高的是乳桿菌屬, 對照組與 3 個處理組的相對豐度均達 51%以上, 其中 JY2 乳桿菌屬含量最高(68.92%), 其次是 JY1 (53.72%)、JY3 (51.67%), 對照組含量最低(51.60%), 乳桿菌屬是泡菜的優勢菌群。JY2 的高乳桿菌屬含量與其適宜的低鈉咸味劑替代率30%(食鹽含量)有關, 即適宜的食鹽濃度有利于乳桿菌屬的生長。乳桿菌屬含量的高低與泡菜風味的形成息息相關, 泡菜中乳桿菌屬利用糖類、蛋白質、有機酸、氨基酸產生揮發性物質, 賦予泡菜特殊風味。明串珠菌屬在泡菜泡制過程中利用葡萄糖進行異性乳酸發酵產生甘露醇,賦予泡菜清爽的甜味。JY3 中明串珠菌屬相對豐度最高(21.19%), 其次是對照組(7.83%)、JY1 (4.03%), JY2 最低(2.80%)。根據韓亞楠等[20]研究發現, 明串珠菌的最適生長溫度是 32~38℃, 且具有較強的耐鹽性, 其原因可能與明串珠菌屬具有耐高鹽和喜高溫的特性有關, 故對照組和JY3 中明串珠菌屬的相對豐度高于 JY1 和 JY2。其他各類細菌菌屬的相對豐度在各組洗澡泡菜中均不超過 1%。一方面是乳酸桿菌屬成為優勢菌后對其他微生物生長的抑制作用,另外可能是食鹽濃度、泡制溫度不適于其他細菌菌屬生長,如普雷沃泰勒菌屬(Prevotella)生長的最適溫度為 37℃且在鹽濃度過高的環境下難以生存, 但其能利用葡萄糖發酵產生乙酸和琥珀酸以及少量的乳酸, 豐富泡菜風味。
圖 1 細菌屬水平前 20 名相對豐度柱狀圖
洗澡泡菜中真菌的物種注釋
由圖 2 可知, 除未分類真菌外, 對照組中漆斑霉菌屬(Myrothecium, 4.91%)相對豐度最高, 漆斑霉菌屬的適宜生長溫度為 28℃且嗜鹽, 此外, 漆斑霉屬產生的漆酶有利于洗澡泡菜中醛類、醇類、酯類等揮發性香氣物質的形成。3 個處理組中毛殼菌(Chaetomium)相對豐度均是最高; JY1中含有脈孢菌(Neurospora, 3.74%)、赤霉菌(Gibberella,3.45%); JY2 中含有赤霉菌(Gibberella, 28.57%)、脈孢菌(Neurospora, 4.96%); JY3 中含有赤霉菌 (Gibberella,3.08%)、被孢霉(Mortieralla, 1.63%)。綜上, 3 個處理組中毛殼菌(Chaetomium)為第一優勢真菌屬, 其中, JY2 的相對豐度最高(37.80%), JY1 次之(5.72%), JY3 最少(5.62%)。姜成研究發現, 毛殼菌生長繁殖的適宜溫度應低于 25℃且食鹽含量過多會抑制其生長, 由此推測 JY2 中毛殼菌屬相對豐度最高的原因是其泡制溫度(25℃)適宜且食鹽含量最低(28 g), JY3 中毛殼菌屬相對豐度最低是因為其泡制溫度稍高(30℃)且食鹽含量較高(36 g)。毛殼菌能供給泡菜泡制過程所需的酶類, 乳酸在酶的作用下生成乳酸乙酯, 形成泡菜的特殊風味。
圖 2 洗澡泡菜真菌在屬水平物種分類熱圖
洗澡泡菜中細菌和真菌 β 多樣性分析
洗澡泡菜中細菌 β 多樣性分析
Bray curtis 距離常用來反映群落之間差異性, Braycurtis 數值越小, 菌落結構相似度越高, 見圖 3。對照組與JY3 的 Bray curtis 值最小(0.391), 與 JY2 最大(0.948), 故JY3在細菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY2與對照組差異最大。歐雪等報道在含鹽量較高的泡菜組別中, 食鹽對菌落的影響不顯著, 故推測 JY3 與對照組在細菌結構上相似的原因是JY3食鹽含量(36 g)與對照組(40 g)最接近;而 JY2 食鹽含量(28 g)與對照組差異較大, 這與呂家樑等研究結果一致, 提示食鹽含量的變化對泡菜菌落結構影響較大。本研究中, JY2 泡制溫度(25℃)同對照組相同, JY3泡制溫度 30℃, 但 JY3 在細菌菌落結構上與對照組相似度最高, 由此推測 5℃的泡制溫度差異可能對泡菜菌落結構影響不大。
圖 3 洗澡泡菜中的細菌 β 多樣性距離熱圖
洗澡泡菜真菌 β 多樣性分析
由圖 4 可知, 對照組與 JY1 的 Bray curtis 值最小(0.148), 與 JY3 最大(0.263), 即 JY1 在真菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY3 與對照組差異最大, 這與 2.2.2 的研究結果一致。
圖 4 洗澡泡菜中的真菌 β 多樣性距離熱圖
洗澡泡菜揮發性風味物質的分析
洗澡泡菜中揮發性化合物的分析
洗澡泡菜的揮發性風味物質主要由兩部分組成: 一部分來自蘿卜、香辛料、調味料本身氣味, 另一部分是蘿卜經過微生物發酵產生的揮發性物質。由表 4 可知, 對照組與 3 個處理組中共檢出 55 種揮發性物質, 其中酚類 5種、醇類 12 種、酯類 12 種、酮類 8 種、醛類 3 種、酸類3 種、吡嗪類 2 種、烴類 4 種、醚類 1 種、雜環類 4 種、含氮化合物 1 種。湯艷燕等[28]采用 GC-MS 檢測了四川傳統泡蘿卜中的揮發性物質, 共檢出 39 種, 其中酯類 8 種、烷烴類 7 種、醛類 4 種、醇類 3 種、芳烴類 2 種, 硫類、烯烴類、酮類、酚類、醚類各 1 種。洗澡泡菜中檢出的揮發性物質較傳統泡菜多出 16 種, 特別是對泡菜風味貢獻較大的醇類、酯類。這是可能是因為傳統泡蘿卜泡制使用的食鹽量多, 其微生物數量減少, 風味物質減少。JY3檢出揮發性物質最多(53 種), 其次是 JY2 (44 種)、對照組(44 種), JY1 最少(41 種), 對照組與 JY2 在檢出揮發性物質種類數上最接近。揮發性風味物質與泡菜中微生物密切相關, 2.1.1(細菌 Alpha 多樣性分析)中 JY2 的細菌物種最豐富, JY1、JY3 最少; 2.2.1(細菌的物種注釋)中 JY2 乳桿菌屬含量最高, 對照組含量最低。細菌物種豐富、乳桿菌屬含量高, 揮發性風味物質種類應越多, 但 JY3 檢出揮發性物質種類是最多的, 這可能與菌群中產揮發性物質的菌種種類及數量有關, 也可能與菌群處于的生長階段有關。對照組與 3 個處理組中均檢出的揮發性物質有 38 種, 與對照組比較, 檢出相同揮發性物質種類最多的是 JY1 (41 種),這可能與 JY1 的乳桿菌屬含量與明串珠菌屬含量與對照組相似度最高有關, 這與 YANG 等[32]的研究一致。
洗澡泡菜 GC-IMS 指紋圖譜分析
表 4 洗澡泡菜中的揮發性化合物
如圖 5 所示, 每列亮點均表示同一保留時間及漂移時間的揮發性化合物的信號峰, 亮點的顏色與范圍代表揮發性化合物含量, 顏色越深、范圍越大, 表明該揮發性化合物的相對含量越高。由圖 5 可知, 對照組與 3 個處理組在特征風味物質上的差異較大, 對照組的特征風味物質是 2-呋喃乙醇; JY1 是丁酸己酯、2-辛酮; JY2 是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、苯乙烯、異戊酸; JY3 是 3-仲丁基-2-甲氧基吡嗪、崁醇、芳樟醇、甲基麥芽酚、苯乙酮、羅勒烯、2,6-二氯酚、松油烯-4-醇、2,4-二氯苯酚。唐麗等報道四川傳統泡菜的特征風味物質是乙酸、丁酸、乙酸乙酯和 2-乙基-1-己醇, 與對照組和 3 個處理組均不同, 因其是傳統發酵泡菜, 且使用成熟泡菜的發酵液進行泡制, 泡制時間較長(5 個月), 故其特征風味物質與本實驗樣品組差異較大。2.3(細菌和真菌 β 多樣性分析)中 JY2 在細菌菌落結構上與對照組差異最大; JY3 在真菌菌落結構上與對照組差異最大。菌落結構的差異會影響特征風味物質的種類。圖5 可知, JY3 中的醇類物質、酚類物質較對照組高, 可能與JY3 中的明串珠菌含量高有關[34]; JY2 中乳桿菌屬的含量最高, 乳桿菌有利于乳酸、乙酸、酯類等風味物質生成,可進一步形成乙酸丁酯。
圖 5 洗澡泡菜中揮發性化合物的指紋圖譜
洗澡泡菜電子舌分析
判別因子分析(discriminant factorial analysis, DFA)是將電子舌的數據重新組合, 縮小組內的變量差距, 并且擴大組間的變量差距, 從而達到區分各種樣品的目的的一種分析方法。將電子舌采集到的響應值數據進行 DFA 分析,由圖 6 可知前 2 個判別因子的貢獻率分別為 79.804%、19.191%, 累計貢獻率達到 98.994%(超過 95%), 說明 2 種主成分包括了對照組和各個處理組的絕大部分的信息。在三維圖中, 組內的每個數據點之間的距離很小, 可以很好地聚集在一起, 各組之間數據點非常明顯地分布在三維圖的各個角落, 由此可以判定, 電子舌能識別出不同處理組洗澡泡菜。JY1 與對照組距離最近, JY3 與對照組距離最遠,說明 JY1 與對照組在滋味上的相似度最高, JY3 與對照組差異最大, 這與低鈉咸味劑替代率、泡制溫度有關。低鈉咸味劑中含有美拉德反應咸味肽、非鈉型咸味物質、果蔬粉或果蔬提取物、酸味粉末物質和鮮味物質, 能提供咸味、酸味、鮮味, 對泡菜滋味影響較大。JY3 的低鈉咸味劑替代率(10%)最少, 但其泡制溫度最高30℃), JY1 的低鈉咸味劑替代率為 20%, 但泡制溫度最低(20℃), 在相同的泡制時間下, 溫度越低, 食鹽、低鈉咸味劑擴散進入蘿卜的速度越慢, 故 JY1 與對照組在滋味上的相似度最高。
結 論
與傳統洗澡泡菜的菌落結構、風味差異最小的低鹽洗澡泡菜是JY1, 即低鹽洗澡泡菜的最佳工藝配方是泡制溫度20℃,泡制時間 48 h, 低鈉咸味劑替代量 20%(食鹽用量 32 g)。
四川傳統洗澡泡菜的優勢菌屬為乳桿菌屬、明串珠菌屬、漆斑霉菌屬, 低鹽洗澡泡菜(3 個處理組)的優勢菌屬為乳桿菌屬、明串珠菌屬、毛殼菌屬。洗澡泡菜中的真菌物種數目比細菌多, JY2 中真菌物種數、細菌物種數均最豐富。JY3 在細菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY2 與對照組差異最大。JY1 在真菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY3 與對照組差異最大?？梢?/span>, 低鈉咸味劑對洗澡泡菜菌落結構存在一定影響。
圖 6 洗澡泡菜電子舌判別因子分析三維圖
結 論
與傳統洗澡泡菜的菌落結構、風味差異最小的低鹽洗澡泡菜是JY1, 即低鹽洗澡泡菜的最佳工藝配方是泡制溫度20℃,泡制時間 48 h, 低鈉咸味劑替代量 20%(食鹽用量 32 g)。
四川傳統洗澡泡菜的優勢菌屬為乳桿菌屬、明串珠菌屬、漆斑霉菌屬, 低鹽洗澡泡菜(3 個處理組)的優勢菌屬為乳桿菌屬、明串珠菌屬、毛殼菌屬。洗澡泡菜中的真菌物種數目比細菌多, JY2 中真菌物種數、細菌物種數均最豐富。JY3 在細菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY2 與對照組差異最大。JY1 在真菌菌落結構上與對照組相似度最高, JY3 與對照組差異最大?？梢?/span>, 低鈉咸味劑對洗澡泡菜菌落結構存在一定影響。
四川傳統洗澡泡菜中檢出揮發性物質 44 種, 其特征風味物質是 2-呋喃乙醇; JY2 與其在揮發性物質種類上差異最小, JY1 與其共有的揮發性物質最多。JY1 中的特征風味物質是丁酸己酯、2-辛酮; JY2 是乙酸丁酯、2-甲基丁酸甲酯、苯乙烯、異戊酸; JY3 是崁醇、芳樟醇、甲基麥芽酚等, 與對照組差異較大。JY1 與對照組在滋味上的相似度最高。綜合菌落結構、揮發性物質以及滋味, JY1 與對照組的品質最接近。低鈉咸味劑量對洗澡泡菜的風味是有顯著影響的, 本研究結果為低鈉咸味劑在洗澡泡菜中的使用提供了理論支撐。
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